Typer av fluorescensmikroskop

När mikroskop uppfanns omkring 1600 v.kr. riktade naturfilosofer blicken mot en värld inom en värld. När Antony van Leeuwenhoek skapade små, mycket böjda linser och en mekanisk hållare för att justera vyn, öppnade han ett fönster mot den mikroskopiska världen av bakterier, blodkroppar, protozoer och cellstrukturen hos växter. Men genom mikroskopins historia har det alltid funnits en fråga: Vad är dessa konstiga saker som ses genom en lins? Fluorescensmikroskopi hänvisar till en uppsättning tekniker som minimerar den osäkerheten - för i fluorescensmikroskopi när ljus skiner på ett prov lyser det sitt eget ljus direkt.

Epifluorescens

Överlägset det vanligaste fluorescensmikroskopet är epifluorescenskonfigurationen. I ett epifluorescensmikroskop lyser en ljuskälla - vanligtvis en kvicksilver- eller xenonlampa - genom ett filter som väljer en smal region av våglängder. Det filtrerade ljuset lyser på provet genom objektivets lins. Det inkommande ljuset absorberas av fluoroforer - molekylära etiketter som avger ljus med lång våglängd när de absorberar ljus med kortare våglängd. Ljus från fluoroforerna, tillsammans med spridd ljus från belysningskällan, går tillbaka in i objektivlinsen och till detektorn eller ögat. Längs vägen blockerar ett annat filter ut belysningsljuset, så allt som återstår är det fluorescerande ljuset från provet.

Konfokal

Ett epifluorescensmikroskop samlar ljus överallt inom mikroskopets synfält. En del av exciteringsljuset absorberas före fokalplanet i mikroskopet, en del i fokalplanet och en del bortom fokalplanet. Eftersom mikroskopet samlar allt detta ljus kommer bilden att innehålla en skarp bild av ljuset i fokus, men det kommer också att ha fokus utanför ljuset från andra regioner. Ett konfokalmikroskop fixar det genom att fokusera en laserfläck i samma plan som mikroskopet är fokuserat. Därefter går ett nålhål framför detektorn, där den blockerar allt ljus som inte kommer från mikroskopfokus. Genom att skanna provet kan en ren tredimensionell bild av objektet erhållas.

Multiphoton

I ett konfokalmikroskop är inriktningen mycket känslig. Om laserfläcken, mikroskopobjektivet, uppsamlingsoptiken och nålhålen är avstängd till och med den minsta mängd som mikroskopprestanda lider. Ett multiphotonmikroskop kringgår problemet genom att använda en laservåglängd som bara är hälften så energisk som det behöver vara för att excitera fluoroforerna i provet. Det enda sättet fluoroforerna kommer att bli upphetsade och avge fluorescens är om laserljuset är tillräckligt starkt så att två ljuspartiklar - fotoner - träffar fluoroforen på mycket kort tid. Det händer bara när lasern är fokuserad till en mycket liten plats. Så det enda stället i provet som kommer att avge ljus är där lasern är fokuserad, vilket håller bilden fin och ren eftersom det inte finns något extra bakgrundsljus att bli av med - vilket innebär att inget nålhål ska justeras.

Total intern reflexionsfluorescens (TIRF)

Ett annat sätt att få mycket rena bilder är att se till att exciteringslampan inte kommer mycket långt in i provet. Om en klump av nervceller, till exempel, placeras i en droppe lösning på en glasskiva, kommer några av neuronerna att fästa vid glasytan. I ett totalt internt reflexionsfluorescensmikroskop (TIRF) riktas ljuset i sidled in i glasskivan så att det inte riktigt kommer in i lösningen som håller cellerna. Men en del av ljuset läcker knappt in i lösningen - bara mycket nära glasytan. Det betyder att de enda platserna som kommer att avge ljus kommer att vara i ett mycket tunt område precis mot glasytan. För något som nervceller, där så mycket intressanta saker händer på cellernas yta, kan denna teknik vara mycket effektiv.

Superupplösning

Alla mikroskop - inklusive fluorescensmikroskop - är begränsade av fysiken som styr utbredningen av ljus. En av de grundläggande reglerna är att en fokuserad ljuspunkt bara kan bli så liten - och inte mindre. För synligt ljus är den storleken ungefär 200 nanometer, eller 200 miljarddelar av en meter. Men enstaka molekyler har bara några nanometer i storlek, så det finns många intressanta funktioner som ligger under den storleksgränsen, som kallas diffraktionsgränsen. Forskare utvecklar "superupplösning" -tekniker för att smyga sig runt den gränsen. Strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) och stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi, till exempel, är båda fluorescensmikroskopimetoder som begränsar storleken på den ljusemitterande platsen genom att krympa storleken på exciteringsljusfläcken.